A lo largo de la historia de la microbiología, los métodos de identificación de bacterias han evolucionado significativamente, pasando de técnicas convencionales como el cultivo y la microscopía a avanzadas tecnologías moleculares y de espectrometría de masas. Tradicionalmente, la identificación de bacterias se realizaba mediante técnicas de cultivo y pruebas bioquímicas, consideradas el estándar de oro para la detección de patógenos y pruebas de susceptibilidad antimicrobiana. Sin embargo, en algunos casos, estos métodos tradicionales proporcionan identificaciones preliminares que requieren confirmaciones adicionales a través de otros métodos.
La identificación bacteriana es esencial en microbiología clínica para diagnosticar infecciones y seleccionar tratamientos adecuados, así como en la investigación, la industria farmacéutica, la agricultura, la industria alimenticia, entre otros campos. Existen varios métodos de identificación bacteriana, entre los cuales destacan la biología molecular, la espectrometría de masas con desorción/ionización por láser asistida por matriz acoplada a un analizador de tiempo de vuelo (MALDI-TOF MS) y el sistema API (Analytical Profile Index). A continuación, se describen algunos de los métodos para la identificación bacteriana:
Idetificación bacteriana por pruebas bioquímicas
Las pruebas bioquímicas para bacterias utilizan reacciones enzimáticas con diferentes productos químicos para detectar visualmente el crecimiento y metabolismo bacteriano en presencia de un sustrato. La identificación bacteriana se basa en perfiles bioquímicos característicos. Algunos ejemplos de pruebas bioquímicas para identificación de bacterias incluyen:
- Hidrólisis del hipurato
- β-galactosidasa (ONPG)
- Aminopeptidasas
- Urea e indol
- Reducción de nitratos
- Rojo de metilo
- Voges-Proskauer
- Agar Hierro de Kligler
- Fermentación de azúcares
- Hidrólisis de esculina
- Coagulasa
- Fenilalanina-desaminasa
- DNasa
- Hidrólisis de gelatina
- Decarboxilasas
- Lipasa
- Lecitinasa
- Uso de citratos
- Uso de malonato
- Prueba de CAMP
- Solubilidad en bilis
Existen sistemas o equipos multipruebas automatizados basados en estas y otras pruebas bioquímicas que permiten una identificación más rápida. Estos sistemas contienen hasta 20 cúpulas con diferentes sustratos y, basándose en cambios de pH, pueden identificar casi 100 taxones. Algunos ejemplos son:
- API (bioMérieux)
- Enterotube (BBL)
- Oxi/Ferm Tube (BD)
- RapID systems y MicroID (Remel)
- Biochemical ID systems (Microgen)
Estos sistemas multipruebas fueron considerados el «estándar de oro» en microbiología clínica por su extensa base de datos. Sin embargo, tienen la desventaja de consumir mucho tiempo, por lo tanto han surgido sistemas automatizados como:
- MicroScan
- Vitek
- ATB
- Pasco
- Wider
- Phoenix
Pruebas moleculares a través de la Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) y secuenciación de ADN
La PCR es un método de amplificación de ácidos nucleicos in vitro mediado por enzimas. Este método amplifica múltiples copias de secuencias de ADN bacteriano utilizando cebadores específicos para ciertos genes útiles en la identificación de bacterias. Posteriormente, se realiza la secuenciación capilar Sanger (CES) o de nueva generación, proporcionando una identificación precisa a nivel de especie, además de ser un método rápido de identificación. Los genes más comúnmente utilizados en la identificación taxonómica bacteriana son:
- 16S rRNA: Se encuentra en la subunidad 30S del ribosoma bacteriano y es el más utilizado en la identificación bacteriana y la asignación de género y especie.
- rpoB (subunidad β de la RNA polimerasa): Esta enzima es esencial para la transcripción y está universalmente distribuida en bacterias, con menor probabilidad de transferencia horizontal de genes. El criterio de inclusión en la misma especie se basa en la hibridación ADN-ADN (DDH < 70%).
- gyrB (subunidad β de la DNA girasa): Esta enzima está implicada en la replicación del ADN bacteriano. Su distribución es universal y la presencia de una sola copia permite la discriminación e identificación de especies relacionadas en géneros como Aeromonas, Pseudomonas, Bacillus, Vibrio, así como en enterobacterias, micobacterias y bacterias ácido lácticas.
Espectrometría de masas con desorción/ionización asistida por láser con matriz (MALDI)-tiempo de vuelo (TOF)
Este método se basa en la ionización de células microbianas mediante pulsos láser cortos y la aceleración de las partículas resultantes en un sistema de vacío utilizando un campo eléctrico. Tras la ionización, se obtiene una huella molecular de masas de péptidos en forma de perfil de espectros, específica para cada microorganismo. Este espectro se compara con una base de datos existente de organismos conocidos, permitiendo su identificación mediante un programa automatizado.
Para realizar MALDI-TOF, una muestra se cultiva en agar y se coloca en una placa MALDI, donde se añade una matriz. La matriz ayuda a transformar el láser en calor, provocando que la muestra se desorba de la placa y forme moléculas ionizadas. Estas moléculas se convierten en gas y vuelan hacia el tubo de tiempo de vuelo (TOF) según su tamaño y carga. Las moléculas con una menor relación tamaño-carga viajan más rápido, creando un espectro basado en el tamaño y la carga de las moléculas.
Este método es muy utilizado para la identificación microbiana en microbiología clínica. Sin embargo, MALDI-TOF detecta los marcadores moleculares de las bacterias solo cuando la cantidad de muestra es detectable, lo cual comúnmente ocurre después de 24 horas de cultivo.
Análisis de ácidos nucleicos por hibridación (PNA-FISH)
Este método identifica bacterias utilizando sondas para identificar RNA. En este procedimiento, se aplican sondas de ácido nucleico peptídico fluorescente (PNA) a bacterias fijadas en una lámina. Estas sondas se hibridan (unen) al RNA y se observan en tiempo real bajo un microscopio de fluorescencia (in situ).
¿Cómo se realiza la identificación bacteriana mediante métodos moleculares?
Para realizar una identificación bacteriana mediante métodos moleculares, se necesita equipo especializado como un termociclador y un secuenciador, reactivos específicos como la enzima Taq polimerasa y primers, además de personal capacitado. A continuación, se describen los pasos generales para realizar la identificación bacteriana mediante técnicas de biología molecular:
- Colecta de muestras
- Las muestras pueden ser obtenidas de sitios de infección (sangre, orina, tejido, etc.), cultivos puros y muestras ambientales (suelo, agua, bioaerosoles, sedimentos, plantas, etc.). Es crucial evitar la contaminación cruzada para asegurar la precisión de los resultados y, en el caso de cultivos, que sean axénicos.
- Extracción de DNA
- El DNA se extrae de la muestra o cultivo puro utilizando kits comerciales de extracción de DNA o mediante métodos no comerciales que implican la preparación de reactivos en laboratorio, los cuales deben estar estériles y libres de contaminantes. Este paso incluye la lisis celular para liberar el DNA de las bacterias, seguido de la purificación del DNA para eliminar lípidos, proteínas y residuos de reactivos propios del método de extracción.
- Amplificación de DNA por PCR
- Se realiza una PCR con cebadores específicos para el gen 16S rRNA o alguno de los marcadores moleculares mencionados anteriormente, para generar múltiples copias de segmentos específicos del DNA bacteriano.
- Secuenciación
- Se obtiene la secuencia del DNA amplificado mediante secuenciación capilar (método de Sanger) o secuenciación masiva (por ejemplo: Illumina, PacBio, Ion Torrent, Oxford Nanopore).
- Análisis bioinformático
- Mediante programas de bioinformática y bases de datos que contienen secuencias genómicas de bacterias cultivadas o no cultivadas, se realizan comparaciones entre las secuencias obtenidas y las de la base de datos para determinar el género y la especie de las bacterias.
Ventajas de la identificación molecular de cepas por genómica y secuenciación
Los métodos basados en biología molecular, como la PCR, son altamente específicos y precisos, permitiendo la identificación exacta de bacterias a nivel de especie y, en algunos casos, a nivel de cepa a partir de pequeñas cantidades de material genético. Esto es especialmente útil para identificar bacterias en muestras con baja carga microbiana. Además, contar con el material genético de la bacteria permite la identificación de genes específicos de resistencia a antibióticos.
Por otra parte, los métodos de identificación molecular de bacterias, a diferencia de métodos como MALDI-TOF MS, se benefician de bases de datos robustas que se actualizan continuamente con información de bacterias cultivadas y no cultivadas de diferentes ambientes. Estas bases de datos no solo incluyen patógenos o muestras clínicas, sino también bacterias de diversos entornos como suelo, sedimento, agua, bioaerosoles, plantas, entre otros.
Dado que una limitante de los sistemas MALDI-TOF MS o API es la cantidad de información disponible en sus bases de datos para la comparación de los espectros generados o de los perfiles de pruebas bioquímicas, los métodos moleculares resultan ser una buena elección para la identificación, clasificación y sistemática más precisa de las bacterias. Estos métodos permiten una identificación inequívoca del microorganismo a nivel de especie.
Aplicaciones de la identificación bacteriana
La identificación bacteriana tiene una amplia gama de aplicaciones en diversas áreas, especialmente en microbiología clínica, investigación, seguridad alimentaria, industria farmacéutica y agrícola, entre otros. A continuación, se detallan algunas de las principales aplicaciones:
- Microbiología Clínica
- Diagnóstico molecular de enfermedades infecciosas: Permite proporcionar un tratamiento antibiótico adecuado y oportuno.
- Epidemiología: Proporciona datos para rastrear brotes de enfermedades e identificar patrones de transmisión, contribuyendo a una adecuada toma de decisiones en salud pública.
- Investigación
- Monitoreo de resistencia a antibióticos: Estudio de la virulencia y los mecanismos de patogenicidad bacteriana.
- Desarrollo de nuevas vacunas.
- Identificación de bacterias degradadoras de contaminantes ambientales: Detección y seguimiento de bacterias indicadoras de contaminación ambiental.
- Industria
- Producción de antibióticos, enzimas y biocombustibles: Identificación de bacterias útiles para estos procesos.
- Seguridad alimentaria: Detección de patógenos en alimentos para prevenir brotes de enfermedades transmitidas por alimentos.
- Verificación de la presencia de contaminantes bacterianos: Aseguramiento de la calidad en la producción y procesamiento de alimentos.
- Verificación de la identidad y pureza de cepas bacterianas: Utilizadas en procesos industriales.
Cursos de bioinformática disponibles
Referencias
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